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CLEANING TECHNOLOGY INSTITUTE
Überprüfung der Flächendesinfektion. Da- her entwickelt das wfk – Cleaning Technolo- gy Institute e. V. derzeit ein kultivierungsun- abhängiges Verfahren, das eine simultane, sichere, sensitive und günstige Detektion aller sechs ESKAPE-Erreger innerhalb von 45 Minuten vor Ort ermöglichen soll.
Der Nachweis beruht auf einer selbsttätig ablaufenden, isothermalen Amplifikation von Zielsequenzen in der DNA vitaler, also nicht durch Desinfektion inaktivierter, ESKAPE-Erreger, die auf einer instituts- intern weiterentwickelten, zweischrittigen SMART-Methodik (signal-mediated am- plification of RNA technology) basiert.
Im ersten Schritt (Abbildung 1a-d) werden die für die sechs ESKAPE-Erreger artspezi- fischen Zielsequenzen konvergent in einen identischen Strang aus RNA überschrieben (der Reporter), welcher als Summenpara- meter für die nachzuweisenden Erreger dient. Im zweiten Schritt (Abbildung 1e-h) löst der Reporter in einer nachgeschalteten Vervielfältigungsreaktion die exponentielle Bildung eines weiteren, funktionalen RNA- Stranges aus (das Amplikon).
Nur vitale ESKAPE-Erreger führen so zur Bildung eines einheitlichen Signals, des Amplikons. Die für die SMART notwendigen Zielsequenzen, DNA-Sonden und Reakti- onsbedingungen wurden bereits für mehre-
re ESKAPE-Erreger erfolgreich etabliert. Die Bildung des Reporters (Abbildung 1d) als auch des Amplikons (Abbildung 1h) konnte in isothermalen Reaktionen unter den an- gestrebten Bedingungen demonstriert wer- den. Durch Verwendung des Reporters zur Generierung des Amplikons konnten beide Schritte erfolgreich verknüpft werden.
Der Nachweis des Amplikons erfolgt durch einen Fluoroswitch-Mechanismus. Dabei bindet das Amplikon an einen komple- mentären einzelsträngigen DNA-Strang, der an einem Ende mit einem Goldnano- partikel (GNP) und am anderen Ende mit einem Quantum Dot (QD) gekoppelt ist.
Ohne Amplikon liegt der DNA-Strang in ei- ner gebogenen Form vor und bringt GNP
Das Bundesministerium für Wirtschaft und Klimaschutz unterstützt das Projekt des WFK.
Wenn mit
dem Testver- fahren Erreger entdeckt werden, zeigt das Verfahren ein sichtbares Leuchten. Nur vitale Erreger lösen die Reaktion aus.
und QD in enge räumliche Nähe (keine Fluoreszenz, „OFF“). Erst in Anwesenheit des Amplikons verbinden sich beide Ein- zelstränge zu einem helikal gewundenen Doppelstrang, der in einer gestreckten Konformation vorliegt und so die Distanz zwischen GNP und QD stark vergrößert.
Nur in diesem Zustand zeigt das QD eine starke Fluoreszenz („ON“). Bei Bestrahlung mit einer handelsüblichen UV-Lampe lässt sich die Fluoreszenz im Reaktionsgefäß op- tisch wahrnehmen. Auf diese Weise kann eine nicht anforderungsgerechte Desinfek- tion von ESKAPE-Erregern direkt vor Ort er- kannt und der Missstand umgehend beho- ben werden. Der Fluoroswitch zwischen den Zuständen „OFF“ und „ON“ konnte in meh- reren Experimenten mit DNA-gekoppelten Fluorophor-Quencher-Systemen (FAM,- BHQ) erfolgreich demonstriert und ein proof of principle erbracht werden (Abbildung 2).
Das IGF-Projekt 21186 N der Forschungs- vereinigung Europäische Forschungsge- meinschaft Reinigungs- und Hygiene- technologie e.V., Campus Fichtenhain 11, 47807 Krefeld, wird über die AiF im Rah- men des Programms zur Förderung der industriellen Gemeinschaftsforschung und -entwicklung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Klimaschutz aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundes- tages gefördert.
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